为了保证屏障级实验动物设施的环境符合国家标准，保证实验动物和动物实验的质量，所有拟进入实验动物设施的物品在进入实验设施前必须经过一定的灭菌验设施。饮用水瓶是实验动物设施中的动物饮用水设备，其消毒灭菌措施一般为高压蒸汽灭菌，国家标准推荐的消毒灭菌温度为121℃，维持20min。在实际工作中，发现动物饮用水瓶，特别是新型塑料饮用水瓶，按上述方法灭菌后会有塑料气味。考虑到装满的水直接饮用到动物体内，应具有良好的理化性能和良好的生物相容性。细胞毒性试验是利用体外细胞培养方法评价生物材料、医疗器械或提取物成分是否具有潜在的细胞毒性，因其简单、快捷、灵敏、节约动物等优点，被列为评价医疗器械毒性的重要指标[1.2]。根据中华人民共和国国家标准《医学生物学评价》（GB/T1686-2003，idtiso1093-5:1992)，本试验采用三种常用消毒灭菌温度对含有动物饮用水的饮用水瓶进行高温蒸汽灭菌，观察灭菌后瓶中饮用水对小鼠成纤维细胞L-929生长抑制的影响，评价这三种灭菌条件中哪一种最好，为日常工作提供数据支持。

1材料及方法。

1.1主要材料和试剂动物饮用水瓶在中国江苏枫叶实验动物笼厂购买。L-929小鼠成纤维细胞株，从中国科学院上海细胞库购买，用于实验的细胞代代数为3~20。高糖DMEM培养基(粉)。新生牛血清均从美国Gibco公司购买。WST-1细胞增殖试剂盒从瑞士Roche公司购买。

1.2实验方法取3个塑料动物饮用水瓶，按每平方厘米内表面积10ml动物饮用水比例加入动物饮用水，盖紧瓶塞。经过100℃60min.11℃40min和121℃20min三种灭菌方法处理后，自然冷却至室温备用。

1.2.1细胞毒性试验按照DMEM培养基(干粉)说明书的配制比例，用不同灭菌处理后的动物饮用水溶解培养基配制细胞培养液，pH值调节为7.4。用直径为0.22μm的滤膜过滤后，加入10%新生牛血清.100U/ml青霉素.100U/ml链霉素，储存4℃备用。

1.2.2细胞形态学观察将生长状态良好的L-929小鼠成纤维细胞按3×104/ml的密度接种到6孔板上，随机分为4组，即对照组。1组(100℃60min组).2组(111℃40min组)和3组(121℃20min组)，每组3个平行样品。细胞在37℃.5%CO2.95%湿度条件下培养24小时后，放弃原培养基，在溶剂对照组中加入新鲜DMEM培养基，其余加入相应动物饮用水的培养基，在细胞培养箱中继续培养。在细胞培养的第2.4.7天，用光学显微镜观察每组细胞并拍照。

1.2.3在细胞培养的第2.4.7天，收集各组的培养基，用胰蛋白酶消化各组细胞，用PBS清洗两次，加入适量的新鲜培养基，用血球计数板在显微镜下进行细胞计数，分别计算失贴壁细胞的数量和数量，并按以下类型计算细胞失贴壁率。细胞失贴壁率(%)=失贴壁细胞数/(失贴壁细胞数+粘贴壁细胞数)×100%细胞以3×104/ml的密度在96孔培养板中接种，每孔体积100μl，细胞分组处理同上。在细胞培养的第2.4.7天，用WST-1分析细胞活性，用酶标仪在490nm波长下测量吸光率(OD)值，并按以下类型计算细胞相对增殖率(RGR)。RGR(%)=实验组细胞OD(490)值/对照组细胞OD(490)值×100%按RGR值对样品的毒性反应进行分类如下:0级为RGR≥100;1级为75~99;2级为50~74;3级为25~49;4级为1~24;5级为0。

1.3统计处理实验计量数据以均值±标准差表示，采用SPSS11.0统计软件，采用完全随机设计的单因素方差分析方法，采用Bonferoni方法，α=0.05为检验水平。

2结果

2.1各组L-929细胞形态学变化光学显微镜下的观察结果显示，对照组细胞形态正常，壁生长良好，呈梭形或不规则三角形。在动物饮用水以不同方式灭菌后的第二天及以后，每组细胞的壁生长仍然相对较好，但可以看到少量的细胞收缩，偶尔。（图1）。

2.2组细胞失贴壁率的变化如表1所示。用不同方式的饮用水制备的培养液后的第二天。与对照组相比，每个实验组的细胞失贴壁率没有显著差异(2=1.90，P>0.05)。第四天，每个实验组的细胞失贴壁率增加，与对照组相比差异非常显著(2=4.262，P.000)。第七天，每个实验组的失贴壁率明显增加(2=42.502，P>000)，其中3组细胞失贴壁率最高，为8.24%，是对照组细胞失贴率的10倍。

2.3各组L-929细胞活性的变化如表2所示。第2天、第4天、第7天，实验组细胞活性明显低于对照组，差异非常显著（第2天，2=13.205，P000；第4天，2=17.731，P000；第7天，2=21.142，P000）。表2中各组的细胞活性。

2.4各组L-929细胞增殖程度的变化如表3所示。第2天、第4天、第7天，实验组细胞增殖程度明显低于对照组，差异非常明显（第2天，2=27.172，P000；第4天，2=15.645，P000；第7天，2=11.087，P000）。每组细胞毒性分为1级或2级。表3每组细胞增殖程度。

3讨论

体外细胞毒性实验是评价材料对细胞生长状况的影响的一种方法，具有通用性，广泛应用于各种设备和材料的生物相容性评价。评价指标一般包括细胞形态学观察、细胞壁状况、细胞活性等[2]。L-929细胞是1948年从小鼠皮下组织中分离出来的成纤维细胞，常用于材料浸提液的细胞毒性实验[4]，并被多个国家标准和卫生部颁布的标准推荐为评价外源性物质细胞毒性的首选细胞[5~7]。为了评价不同灭菌处理后动物饮用瓶的生物安全性，选择小鼠L-929细胞作为受试者，添加不同灭菌处理后动物饮用水培养细胞，观察L-929细胞的毒性反应。研究结果表明，不同高压消毒方法消毒后，动物饮用水可在一定程度上改变L-929细胞的生长形态，细胞变圆、皱缩，细胞失贴壁率明显上升。这些结果表明，这些高压消毒方法会影响动物饮用水瓶的生物相容性。综合比较几个指标，可以发现100℃60min高压消毒方法消毒动物饮用水瓶后，动物饮用水的生物相容性接近对照组，应该是更好的高压消毒方法。