德阳地区结核分枝杆菌耐药基因突变位点的分布
作者：admin时间：2019-03-22 08:16:14阅读：298来源：本站
结核分枝杆菌是重要的致病菌，WHO 报告 2012年全球大约有 860 万新发结核病患者，中国约有 100万结核病患者，其中耐多药结核患者约占 5.7%，而再治疗的结核病患者中耐多药结核患者约占 26%。结核分枝杆菌对异烟肼及利福平同时耐药即为耐多药结核，该病严重阻碍了结核病防治的进展，已成为全球严重的公共卫生问题。结核杆菌分离培养及菌种鉴定是目前较常用的方法，该方法检测周期长，检出率较低，不利于及时发表指导临床诊疗。结核分枝杆菌耐药基因检测是一种快速、灵敏度高、特异性强的检测方法，有利于发表指导临床的诊断和治疗。目前常见的基因突变位点分别为利福平 rpoB 基因的 511、513、516、519、522、523、526、529、531 及 533 位 点，异 烟 肼katG 基因的 315 位点和 inhA 基因的 -15 位点，链霉素 rpsL 基因的 43 及 88 位点及乙胺丁醇 embB 基因的306 位点等。我院分子生物学实验室在2010年2月－2013 年 3 月共检测出结核分枝杆菌 DNA 阳性的肺结核患者 257 例，对上述患者的标本进行耐药基因突变位点检测，探索本地区结核分枝杆菌的耐药基因突变位点的分布特点及基因型耐药情况，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院临床分子生物学实验室 2010 年 2 月－2013 年 3 月所有送检痰液标本中结核分枝杆菌 DNA阳性的257 例患者标本（排除重复送检及同一患者送检的标本），其中男198例，女59例；年龄10～86岁，平均（50.5 ± 19.6）岁。所有结核分枝杆菌 DNA 阳性标本均保存于−70℃冰箱冻存并统一进行耐药基因突变位点检测。肺结核依据原卫生部 WS 288－2008 肺结核的诊断标准。本研究方案通过德阳市人民医院伦理委员会审查。
1.2 仪器和试剂
结核分枝杆菌核酸检测试剂盒购自凯杰生物工程（深圳）有限公司，采用瑞士罗氏公司 LightCycler480 进行检测。结核分枝杆菌核酸采用美国伯乐公司PTC-200 型梯度聚合酶链式反应（PCR）分析仪进行PCR 扩增。结核耐药突变基因检测试剂盒购自亚能生物技术（深圳）有限公司。
1.3 检测方法
结核耐药突变基因检测试剂盒采用基因芯片技术，检测 rpoB、katG、inhA、embB、rpsL 等 5 个结核耐药基因的 13 种耐药突变位点，提示对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇等 4 种一线抗结核药物的耐药性（表 1）。本研究按照结核耐药突变基因检测试剂盒说明书发表对结核 DNA 阳性标本的 PCR 扩增、杂交及显色等操作，根据试剂盒说明书进行检测结果判定。
表 1 结核分枝杆菌基因突变位点所对应的耐药信息
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，计数资料采用 χ2检验，P 值＜ 0.05 为有统计学意义。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌耐药基因突变位点的检测结果
257 例肺结核患者中结核分枝杆菌耐药基因突变位点全部为野生型者 208 例（80.93%）；至少 1 个位点突变者 49 例（19.07%），其中单个位点突变者 27 例（10.51%），2 个或 2 个以上位点突变者 22 例（8.56%）。
2.2 肺结核患者结核分枝杆菌耐药基因突变位点的分布情况
257 例肺结核患者的痰液标本中检测出 49 例存在耐药基因位点突变，其中 katG 315 位点和 inhA-15位点突变分别为 30、7 例；rpoB 531、526、516 位点突变分别为 10、1、1 例，511 或 513 位点突变 4 例，526或 529 位点突变 1 例；embB 306 位点突变 11 例；rpsL43 和 88 位点突变分别为 18、5 例，而其他位点未检测出耐药突变位点。全部耐药突变位点中，katG 315位点突变最多，突变率达 11.67%（30/257），其次分别为 rpsL 43 位点突变（7.00%）和 embB 306 位点突变（4.28%）。见表 2。
表 2 肺结核患者结核分枝杆菌耐药基因突变位点的分布
2.3 肺结核患者的基因型耐药的分布情况
257 例肺结核患者中，初治肺结核患者 234 例，复治肺结核患者 23 例。初治肺结核患者中单耐异烟肼、利福平和链霉素的患者分别为 11 例（4.70%）、3 例（1.28%）和 7 例（2.99%），未检测出单耐乙胺丁醇的患者；任耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素的患者分别为23例（9.83%）、10例（4.27%）、8例（3.42%）和 12 例（5.13%）；耐多药患者 7 例（2.99%）。复治肺结核患者中，单耐异烟肼和利福平的患者分别为 3 例（13.04%）和 3 例（13.04%），未检测出单耐乙胺丁醇及单耐链霉素的患者；任耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素的分别为 12 例（52.17%）、6 例（26.09%）、3 例（13.04%）和 10 例（43.48%）；耐多药 3 例（13.04%）。在单耐、任耐及耐多药结核的患者中，初治患者的耐药比例均明显低于复治患者。初治和复治患者中，对异烟肼耐药的患者例数最多，分别为 9.83% 和52.17%。在 1 例初治和 1 例复治患者中同时检测出对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素耐药。见表 3。
表 3 肺结核患者的结核分枝杆菌基因型耐药情况
3 讨论
结核分枝杆菌耐药的主要机制是因为基因突变。研究表明异烟肼耐药与过氧化氢酶 - 过氧化物酶编码基因 katG 中 315 位点和（或）烯酰基还原酶编码基因 inhA 中 -15 位点等基因突变有关。利福平耐药主要是由于 rpoB 基因编码区发生了点突变、微缺失或微插入等，导致编码的 RNA 聚合酶 β 亚基构象发生变化，使其与利福平的亲合力下降，其主要突变形式是 531、526 和 516 位点突变。引起乙胺丁醇耐药的变异主要是 embB 基因 306 位点的变异，引起链霉素耐药的变异主要是 rpsL 基因 43 和 88 位点的变异。通过对上述基因突变位点的检测，临床上能快速确定菌株对常见抗结核药物的基因型耐药情况。本研究对 257 例肺结核分枝杆菌 DNA 阳性标本进行上述耐药基因突变位点检测，发现异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素均存在耐药基因位点突变。耐药基因突变位点较高的分别为 katG 315 位点（11.67%）、rpsL43 位点（7.00%）、embB 306 位点（4.28%）和 rpoB 531丝氨酸突变位点（S531L）（3.89%）。本研究中，katG315 突变位点在耐异烟肼中的发生频率为 85.71%（30/35），rpsL 43 突变位点在耐链霉素中的发生频率为 81.82%（18/22），rpoB 531 位点丝氨酸突变在耐利福平中的发生频率为 62.5%（10/16），耐乙胺丁醇的embB 306 位点突变 11 例。上述突变位点均为耐药发生的主要突变位点，与文献报道相似。
本研究中，257 例肺结核患者中至少 1 种药物的基因型耐药率为 19.07%，对各药物的耐药率依次为异烟肼＞链霉素＞利福平＞乙胺丁醇。复治肺结核患者对上述 4 种药物的基因型耐药率均明显高于初治患者，与文献报道相似。本研究还显示，异烟肼耐药患者中耐多药率为 28.57%（10/35），利福平耐药患者中耐多药率为 62.5%（10/16），乙胺丁醇耐药患者中耐多药率为 63.64%（7/11），提示对其中 1 种药物耐药后可能增加耐多药风险。
国内文献报道，结核分枝杆菌的耐多药率为11.58% ～ 38.60%，初治耐多药率为 6.33% ～ 6.95%，复治耐多药率为 34.39% ～ 37.50%；本研究中肺结核患者的基因型耐多药率为 3.89%，初治患者的耐多药率为 2.99%，复治患者的耐多药率为13.04%，均明显低于上述研究的结果。文献报道，肺结核患者中分离的结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素的耐药率分别为 14.2% ～ 31.9%、15.1% ～ 33.7%、8.9% ～ 16.5% 和 18.6% ～ 25.3%，耐多药率为 23.3% ～ 27.5%；本研究中，肺结核分枝杆菌对上述药物的基因型耐药率分别为 13.62%、6.23%、4.28% 和 8.56%，基因型耐多药率为 3.89%，均低于上述文献报道结果。其原因可能为本研究中检测的结核分枝杆菌均为基因型耐药，其检测的突变位点均为常见的耐药位点，其他较少见的耐药位点未进行检测；可能由于本地区结核分枝杆菌耐药率较其他地区低。结核分枝杆菌的基因型耐药与表型耐药之间的关系尚有待进一步研究证实。
结核耐药不仅是全球面临的公共卫生问题，也是我国亟需面对和解决的难题。准确而快速地确定结核分枝杆菌有无耐药及耐药情况将有助于发表指导临床诊疗，制定有效的防治方案，提高治愈率，减少结核分枝杆菌尤其是耐药结核分枝杆菌的传播。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院临床分子生物学实验室 2010 年 2 月－2013 年 3 月所有送检痰液标本中结核分枝杆菌 DNA阳性的257 例患者标本（排除重复送检及同一患者送检的标本），其中男198例，女59例；年龄10～86岁，平均（50.5 ± 19.6）岁。所有结核分枝杆菌 DNA 阳性标本均保存于−70℃冰箱冻存并统一进行耐药基因突变位点检测。肺结核依据原卫生部 WS 288－2008 肺结核的诊断标准。本研究方案通过德阳市人民医院伦理委员会审查。
1.2 仪器和试剂
结核分枝杆菌核酸检测试剂盒购自凯杰生物工程（深圳）有限公司，采用瑞士罗氏公司 LightCycler480 进行检测。结核分枝杆菌核酸采用美国伯乐公司PTC-200 型梯度聚合酶链式反应（PCR）分析仪进行PCR 扩增。结核耐药突变基因检测试剂盒购自亚能生物技术（深圳）有限公司。
1.3 检测方法
结核耐药突变基因检测试剂盒采用基因芯片技术，检测 rpoB、katG、inhA、embB、rpsL 等 5 个结核耐药基因的 13 种耐药突变位点，提示对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇等 4 种一线抗结核药物的耐药性（表 1）。本研究按照结核耐药突变基因检测试剂盒说明书发表对结核 DNA 阳性标本的 PCR 扩增、杂交及显色等操作，根据试剂盒说明书进行检测结果判定。
表 1 结核分枝杆菌基因突变位点所对应的耐药信息
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，计数资料采用 χ2检验，P 值＜ 0.05 为有统计学意义。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌耐药基因突变位点的检测结果
257 例肺结核患者中结核分枝杆菌耐药基因突变位点全部为野生型者 208 例（80.93%）；至少 1 个位点突变者 49 例（19.07%），其中单个位点突变者 27 例（10.51%），2 个或 2 个以上位点突变者 22 例（8.56%）。
2.2 肺结核患者结核分枝杆菌耐药基因突变位点的分布情况
257 例肺结核患者的痰液标本中检测出 49 例存在耐药基因位点突变，其中 katG 315 位点和 inhA-15位点突变分别为 30、7 例；rpoB 531、526、516 位点突变分别为 10、1、1 例，511 或 513 位点突变 4 例，526或 529 位点突变 1 例；embB 306 位点突变 11 例；rpsL43 和 88 位点突变分别为 18、5 例，而其他位点未检测出耐药突变位点。全部耐药突变位点中，katG 315位点突变最多，突变率达 11.67%（30/257），其次分别为 rpsL 43 位点突变（7.00%）和 embB 306 位点突变（4.28%）。见表 2。
表 2 肺结核患者结核分枝杆菌耐药基因突变位点的分布
2.3 肺结核患者的基因型耐药的分布情况
257 例肺结核患者中，初治肺结核患者 234 例，复治肺结核患者 23 例。初治肺结核患者中单耐异烟肼、利福平和链霉素的患者分别为 11 例（4.70%）、3 例（1.28%）和 7 例（2.99%），未检测出单耐乙胺丁醇的患者；任耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素的患者分别为23例（9.83%）、10例（4.27%）、8例（3.42%）和 12 例（5.13%）；耐多药患者 7 例（2.99%）。复治肺结核患者中，单耐异烟肼和利福平的患者分别为 3 例（13.04%）和 3 例（13.04%），未检测出单耐乙胺丁醇及单耐链霉素的患者；任耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素的分别为 12 例（52.17%）、6 例（26.09%）、3 例（13.04%）和 10 例（43.48%）；耐多药 3 例（13.04%）。在单耐、任耐及耐多药结核的患者中，初治患者的耐药比例均明显低于复治患者。初治和复治患者中，对异烟肼耐药的患者例数最多，分别为 9.83% 和52.17%。在 1 例初治和 1 例复治患者中同时检测出对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素耐药。见表 3。
表 3 肺结核患者的结核分枝杆菌基因型耐药情况
3 讨论
结核分枝杆菌耐药的主要机制是因为基因突变。研究表明异烟肼耐药与过氧化氢酶 - 过氧化物酶编码基因 katG 中 315 位点和（或）烯酰基还原酶编码基因 inhA 中 -15 位点等基因突变有关。利福平耐药主要是由于 rpoB 基因编码区发生了点突变、微缺失或微插入等，导致编码的 RNA 聚合酶 β 亚基构象发生变化，使其与利福平的亲合力下降，其主要突变形式是 531、526 和 516 位点突变。引起乙胺丁醇耐药的变异主要是 embB 基因 306 位点的变异，引起链霉素耐药的变异主要是 rpsL 基因 43 和 88 位点的变异。通过对上述基因突变位点的检测，临床上能快速确定菌株对常见抗结核药物的基因型耐药情况。本研究对 257 例肺结核分枝杆菌 DNA 阳性标本进行上述耐药基因突变位点检测，发现异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素均存在耐药基因位点突变。耐药基因突变位点较高的分别为 katG 315 位点（11.67%）、rpsL43 位点（7.00%）、embB 306 位点（4.28%）和 rpoB 531丝氨酸突变位点（S531L）（3.89%）。本研究中，katG315 突变位点在耐异烟肼中的发生频率为 85.71%（30/35），rpsL 43 突变位点在耐链霉素中的发生频率为 81.82%（18/22），rpoB 531 位点丝氨酸突变在耐利福平中的发生频率为 62.5%（10/16），耐乙胺丁醇的embB 306 位点突变 11 例。上述突变位点均为耐药发生的主要突变位点，与文献报道相似。
本研究中，257 例肺结核患者中至少 1 种药物的基因型耐药率为 19.07%，对各药物的耐药率依次为异烟肼＞链霉素＞利福平＞乙胺丁醇。复治肺结核患者对上述 4 种药物的基因型耐药率均明显高于初治患者，与文献报道相似。本研究还显示，异烟肼耐药患者中耐多药率为 28.57%（10/35），利福平耐药患者中耐多药率为 62.5%（10/16），乙胺丁醇耐药患者中耐多药率为 63.64%（7/11），提示对其中 1 种药物耐药后可能增加耐多药风险。
国内文献报道，结核分枝杆菌的耐多药率为11.58% ～ 38.60%，初治耐多药率为 6.33% ～ 6.95%，复治耐多药率为 34.39% ～ 37.50%；本研究中肺结核患者的基因型耐多药率为 3.89%，初治患者的耐多药率为 2.99%，复治患者的耐多药率为13.04%，均明显低于上述研究的结果。文献报道，肺结核患者中分离的结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素的耐药率分别为 14.2% ～ 31.9%、15.1% ～ 33.7%、8.9% ～ 16.5% 和 18.6% ～ 25.3%，耐多药率为 23.3% ～ 27.5%；本研究中，肺结核分枝杆菌对上述药物的基因型耐药率分别为 13.62%、6.23%、4.28% 和 8.56%，基因型耐多药率为 3.89%，均低于上述文献报道结果。其原因可能为本研究中检测的结核分枝杆菌均为基因型耐药，其检测的突变位点均为常见的耐药位点，其他较少见的耐药位点未进行检测；可能由于本地区结核分枝杆菌耐药率较其他地区低。结核分枝杆菌的基因型耐药与表型耐药之间的关系尚有待进一步研究证实。
结核耐药不仅是全球面临的公共卫生问题，也是我国亟需面对和解决的难题。准确而快速地确定结核分枝杆菌有无耐药及耐药情况将有助于发表指导临床诊疗，制定有效的防治方案，提高治愈率，减少结核分枝杆菌尤其是耐药结核分枝杆菌的传播。
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